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  • 胃癌组织中mdm2和Rb基因表达及临床意义
  • 发布时间:2019-01-08 15:53 | 作者:未知 | 来源:网上收集 | 浏览:
  • 【摘要】  目的:探讨mdm2, Rb基因表达与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系. 方法:采用免疫组织化学技术(S?P法)检测18例正常胃黏膜、26例异型增生胃黏膜、18例早期胃癌、38例进展期胃癌患者组织中的MDM2, Rb基因蛋白的表达情况,并与临床病理特征相比较. 在此基础上,我们通过RNAi技术特异性降低mdm2的表达水平,观察细胞周期的变化,探讨了mdm2作用的分子机制. 结果:MDM2蛋白在正常胃黏膜、I型及II型增生胃黏膜、早期胃癌及进展期胃癌组织中的阳性表达率分别为33.3%,40.0%,43.8%,55.6%, 57.9%. Rb蛋白的阳性表达率分别为94.4%,100.0%, 81.3%,55.6%,63.2%. 随着胃黏膜病变的进展,MDM2表达率逐渐增高,在进展期胃癌中达到高峰,但各组间相比差异无统计学意义(P>0.05). Rb的表达呈相反的趋势,在I型增生中表达最高,到进展期胃癌时表达最低. 在I型增生胃黏膜中的表达率与早期胃癌、进展期胃癌相比,差异均有统计学意义(P均<0.05). MDM2蛋白表达与胃癌淋巴结转移、浸润深度有关. Rb蛋白表达与胃癌临床病理学相关指标间无关. MDM2和Rb在胃癌中的表达呈负相关(P<0.01, γs=-0.475). 干涉mdm2后可以明显抑制细胞的增殖. 结论:MDM2, Rb的表达可作为判断胃癌生物学行为的一个指标,对预后有一定的指导意义;特异性降低mdm2的表达可以作为胃癌治疗的一个分子靶点. 
    【关键词】  胃肿瘤 癌前状态 mdm2基因 Rb基因 免疫组化 RNA干扰 细胞增殖
         0引言
        胃癌的发生是一个多阶段、多步骤逐渐演进的过程. 这一过程中涉及多种癌基因的激活及抑癌基因的失活. mdm2在多种恶性肿瘤中有基因的突变、扩增及过度表达[1]. 但mdm2在胃黏膜早期癌变,特别是与抑癌基因Rb在胃黏膜癌变过程中的协调作用研究较少. 因此本研究应用免疫组化法检测从正常胃黏膜、胃黏膜增生、早期胃癌及进展期胃癌这一序列变化中MDM2和Rb基因的表达,探讨两者与胃癌发生及胃癌生物学行为的关系. 在此基础上,我们拟进一步分析mdm2对细胞周期的影响.
        1材料和方法
        1.1材料①标本: 取自河南科技大学第一附属医院2003/2007年胃切除标本100例. 其中正常胃黏膜18例,I型增生10例,II型增生16例,早期胃癌18例,进展期胃癌38例. 患者术前均未接受化疗或放疗. 所有胃癌病例均经病理证实,并附有完整的临床病理资料. 诊断标准参照全国胃癌协作组病理组规定的标准,胃癌组织学类型根据Lauren分型标准,分为两大类,肠型胃癌40例,弥漫性胃癌16例. ②试剂:  鼠抗人MDM2 mAb抗体、Rb鼠抗人mAb抗体和免疫组化染色S?P试剂盒及DAB显色剂均购自福州迈新生物技术开发公司产品公司. MDM2工作浓度为1∶20,Rb为即用型工作液. 针对mdm2靶序列AAGACACTTATACTATGAAAG和不针对任何序列的对照双链RNA干涉序列由上海吉玛基因公司合成. 针对mdm2 的PCR引物5′?CTGTGTTCAGTGGCGATTGG?3′,5′?AGGGTCTCTTGTTCCGAAGC?3′以及GAPDH的引物5′?CAATGACCCCTTCATTGACC?3′,5′?GATCTCGCTCCTGGAAGATG?3′交由上海生工生物有限公司合成. SYBR Green荧光染料购自Takara生物有限公司. 胃癌细胞系SGC?7901购自上海细胞所.
        1.2方法
        1.2.1标本处理所有标本均经40 g/L甲醛固定,常规石蜡包埋,连续切片,片厚4 μm. 载玻片以10 g/L多聚赖氨酸(福州迈新生物技术开发公司产品) 预处理.
        1.2.2免疫组化石蜡切片脱腊至水;拟滴加一抗为MDM2基因蛋白的组织切片用pH 6.0枸橼酸缓冲液高压热修复10 min,拟滴加一抗为Rb基因蛋白的组织切片用pH 8.0 EDTA缓冲液高压热修复10 min;修复后的切片在缓冲液中冷却后,滴加过氧化物酶阻断溶液;用50~100 mL/L正常山羊血清封闭,滴加一抗,4℃冰箱孵育过夜;滴加生物素标记的第二抗体,滴加链霉菌抗生物素过氧化物酶溶液;DAB显色. 此外用PBS置换一抗作为空白对照,用试剂盒提供的阳性片作阳性对照. MDM2和Rb蛋白表达阳性细胞着色为细胞核及部分胞质内棕黄色颗粒. 在光学显微镜下每张切片随机选择5个区域进行细胞计数,每个区域计数100个肿瘤细胞,阳性细胞比例超过10%为阳性表达,小于10%为阴性表达. SGC?7901细胞在含100 mL/L血清的1640培养基,50 mL/L的CO2的条件下培养. 按Lipofectamine2000的说明书操作,将化学合成的siRNA导入7901细胞. 转染24 h后,收集细胞,提取RNA,反转录成cDNA后进行实时定量PCR检测干涉效果. 为研究干涉mdm2后细胞增殖的变化,将转染24 h后的细胞按每孔1000个细胞均匀铺至96孔板,分别培养24,48,72 h,收集细胞台盼蓝染色后,取样细胞计数台盼蓝染色阳性的细胞数目,统计细胞增殖情况. 细胞计数实验每孔重复4次.
        统计学处理:实验所得的数据采用χ2检验和Spearman等级相关分析,P<0.05为有统计学意义.
        2结果
        2.1MDM2和Rb在胃癌及癌前病变中的表达MDM2蛋白在正常胃黏膜、 I型及II型增生胃黏膜、 早期胃癌及进展期胃癌组织中的阳性表达率分别为33.3%(6/18), 40.0%(4/10), 43.8%(7/16), 55.6%(10/18)及57.9%(22/38);Rb的阳性表达率分别为94.4%(17/18),100.0%(10/10),81.3%(13/16),55.6%(10/18),63.2%(24/38). Rb在I型增生胃黏膜的表达率与早期胃癌及进展期胃癌相比差异有统计学意义(P均<0.05,图1,2).
        A: 在胃黏膜I型增生中的表达; B: 在胃黏液腺癌中的表达.
        图1Rb基因表达SP ×400
        A: 在胃黏膜中度异型增生中的表达; B: 在胃低分化腺癌中的表达.
        图2mdm2基因表达SP ×400
        2.2MDM2和Rb蛋白表达与胃癌临床病理特征的关系MDM2在浸润深度达浆膜组的表达率高于浸润深度达肌层组(P<0.05),MDM2在淋巴结转移组的阳性率高于淋巴结未转移组的阳性率(P<0.01). Rb的表达与临床病理特征无关(表1).表1MDM2, Rb表达与胃癌临床病理特性的关系
        2.3胃癌中MDM2蛋白表达和Rb蛋白表达的相关性56例胃癌组织中,MDM2和Rb共同阳性10例,共同阴性5例,表达一致者15例,不一致者41例,MDM2阳性Rb阴性者22例,MDM2阴性Rb阳性者19例. 采用Spearman等级相关分析, γs=-0.475, P<0.01,说明两者表达有负相关关系.
        2.4mdm2干涉后细胞增殖抑制SGC?7901细胞转染干涉mdm2的干涉序列24 h后,与对照相比, mdm2的表达水平下降(图3). 在明确干涉效果后,我们进一步分析了细胞增殖情况,图4显示干涉mdm2后细胞增殖明显抑制.
        3讨论
        mdm2是一种进化保守的基因,基因位于12q13?14染色体区域,编码区1.476 kb.其表达产物是一种Mr为90×103的蛋白质,蛋白质位于细胞核,半衰期很短, 是调节p53, Rb通路的重要因子.目前认为mdm2产物可分别与p53, Rb结合而使其功能丧失,
        图3化学合成的siRNA 抑制mdm2的表达
        图4干涉mdm2后细胞增殖受到抑制
        从而调节细胞周期,以维持细胞增殖及分化平衡[1-2]. 因此,认为mdm2与p53, Rb之间存在着互为作用的负调节机制[3-4]. 研究证明,在多种肿瘤组织中存在mdm2基因突变、扩增及表达异常. mdm2过表达有可能通过不同的途径减弱或消除p53及Rb抑制细胞生长的功能,使细胞持续不断地由G1期进入S期,从而引起细胞无限制增殖,最终发生恶变[5-6]. Rb基因是人类发现的第一个抑癌基因,首先在视网膜母细胞瘤中被发现并克隆成功,它与p53基因一起被认为是最重要的两大抑癌基因. Rb基因定位于染色体13q14区,表达蛋白是一种转录因子,位于细胞核内. Rb蛋白是通过磷酸化及去磷酸化方式来调节细胞周期的,并与p16,CDK4/6,CyclinD1等多种因子形成复杂的反馈调节网络,在细胞周期G1/S检查点,决定细胞增殖进程. 至今已在视网膜母细胞瘤、食管癌、乳腺癌、结肠癌、前列腺癌等多种肿瘤中发现rb基因的突变及表达缺失,表明rb基因与肿瘤的发生密切相关[7].

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